I. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊNH LUẬT LAMBERT-BEER

1. Định luật Lambert-Beer là gì?

Tên gọi đầy đủ: Định luật Lambert-Beer, còn được gọi là định luật Bouguer-Lambert-Beer hoặc định luật Beer-Lambert.

Lĩnh vực: Định luật Lambert-Beer thuộc lĩnh vực quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis spectrophotometry), là một trong những định luật cơ bản nhất trong hóa học phân tích.

Vai trò: Định luật mô tả mối quan hệ định lượng giữa sự hấp thụ ánh sáng của một dung dịch với nồng độ chất hấp thụ và chiều dày lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua.

Ứng dụng chính: Xác định nồng độ của chất trong dung dịch thông qua phép đo độ hấp thụ ánh sáng. Đây là phương pháp phân tích định lượng nhanh, chính xác và được sử dụng rộng rãi.

2. Lịch sử phát triển

Định luật Lambert-Beer là kết quả của sự đóng góp của nhiều nhà khoa học qua các thời kỳ:

Pierre Bouguer (1729): Nhà khoa học người Pháp là người đầu tiên nghiên cứu có hệ thống về sự suy giảm cường độ ánh sáng khi truyền qua một môi trường vật chất. Ông phát hiện ra rằng cường độ ánh sáng giảm theo hàm mũ khi đi qua môi trường hấp thụ.

Johann Heinrich Lambert (1760): Nhà toán học và vật lý người Đức đã phát triển nghiên cứu của Bouguer và thiết lập mối quan hệ toán học giữa sự suy giảm cường độ ánh sáng với chiều dày của lớp vật chất mà ánh sáng truyền qua.

August Beer (1852): Nhà vật lý người Đức đã bổ sung yếu tố quan trọng cuối cùng – mối quan hệ giữa sự hấp thụ ánh sáng với nồng độ của chất hấp thụ trong dung dịch. Ông chứng minh rằng độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ.

Sự kết hợp các phát hiện này tạo nên định luật hoàn chỉnh mang tên Lambert-Beer, mặc dù đôi khi còn được gọi là định luật Bouguer-Lambert-Beer để ghi nhận đóng góp của cả ba nhà khoa học.

3. Ý nghĩa thực tiễn

Định luật Lambert-Beer có ý nghĩa quan trọng và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:

Hóa học phân tích:

• Xác định nồng độ chính xác của chất trong dung dịch
• Phân tích định lượng các ion kim loại, hợp chất hữu cơ
• Nghiên cứu động học phản ứng hóa học
• Xác định hằng số cân bằng

Kiểm tra chất lượng:

• Thực phẩm: Xác định hàm lượng vitamin, protein, chất màu
• Dược phẩm: Kiểm soát hàm lượng dược chất, độ tinh khiết
• Mỹ phẩm: Phân tích thành phần hoạt chất
• Nước uống: Kiểm tra độ sạch, tạp chất

Nghiên cứu môi trường:

• Đo nồng độ các chất ô nhiễm trong nước (nitrat, phosphat, kim loại nặng)
• Kiểm tra chất lượng không khí (NO₂, SO₂, O₃)
• Phân tích nước thải công nghiệp
• Theo dõi biến đổi môi trường

Y học và sinh học:

• Xét nghiệm máu: hemoglobin, glucose, bilirubin, cholesterol
• Phân tích nước tiểu: protein, ketone
• Nghiên cứu protein, DNA, RNA
• Đo hoạt độ enzyme

Công nghiệp:

• Kiểm soát quy trình sản xuất
• Đảm bảo chất lượng sản phẩm
• Tự động hóa phân tích
• Giám sát trực tuyến

II. PHÁT BIỂU ĐỊNH LUẬT LAMBERT-BEER

1. Phát biểu định luật

Định luật Lambert-Beer phát biểu:

Khi chiếu một chùm ánh sáng đơn sắc có cường độ $I_0$ qua một dung dịch chứa chất hấp thụ ánh sáng, cường độ ánh sáng truyền qua dung dịch $I$ phụ thuộc vào:

• Nồng độ của chất hấp thụ ánh sáng (C)
• Chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua (ℓ)
• Bản chất của chất hấp thụ, được đặc trưng bởi hệ số hấp thụ mol (ε)

Phát biểu ngắn gọn:

Độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ chất hấp thụ và chiều dày lớp dung dịch.

2. Sơ đồ minh họa

Mô hình hấp thụ ánh sáng:

Nguồn sáng        Cuvet chứa dung dịch         Detector
                  
    I₀      →  │================│  →      I
Cường độ       │  Nồng độ: C    │     Cường độ
ban đầu        │  Chiều dày: ℓ  │     truyền qua
               │================│
                     
                I < I₀ (ánh sáng bị hấp thụ)

Giải thích hiện tượng:

• $I_0$ (Cường độ ánh sáng tới): Là cường độ của chùm ánh sáng đơn sắc chiếu vào dung dịch, được đo bằng cường độ ánh sáng truyền qua dung môi thuần khiết (mẫu trắng).
• $I$ (Cường độ ánh sáng truyền qua): Là cường độ chùm ánh sáng sau khi đi qua dung dịch chứa chất hấp thụ. Một phần năng lượng ánh sáng đã bị hấp thụ bởi các phân tử/ion trong dung dịch.
• Quan hệ: $I < I_0$ vì một phần năng lượng ánh sáng đã bị hấp thụ, làm kích thích electron trong phân tử lên mức năng lượng cao hơn.

3. Các đại lượng liên quan

Giải thích các đại lượng quan trọng:

Độ truyền qua (T – Transmittance):

• Là tỉ số giữa cường độ ánh sáng truyền qua và cường độ ánh sáng tới
• $T = \frac{I}{I_0}$, với $0 \leq T \leq 1$ (hoặc 0% đến 100%)
• T = 1 (100%): Ánh sáng truyền qua hoàn toàn (không hấp thụ)
• T = 0 (0%): Ánh sáng bị hấp thụ hoàn toàn

Độ hấp thụ (A – Absorbance):

• Là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền qua
• $A = \log\frac{I_0}{I} = -\log T$
• Không có đơn vị (đại lượng không thứ nguyên)
• A = 0: Không hấp thụ (T = 100%)
• A càng lớn: Hấp thụ càng nhiều

Hệ số hấp thụ mol (ε – Molar absorptivity):

• Đặc trưng cho khả năng hấp thụ ánh sáng của chất
• Phụ thuộc vào bản chất chất hấp thụ và bước sóng ánh sáng
• ε lớn → chất hấp thụ mạnh → phương pháp nhạy
• Đơn vị: L·mol⁻¹·cm⁻¹ (đọc: lít trên mol trên xentimét)

III. CÔNG THỨC ĐỊNH LUẬT LAMBERT-BEER

1. Công thức cơ bản

📌 Dạng 1: Theo cường độ ánh sáng

Dạng hàm mũ: $$I = I_0 \cdot 10^{-\varepsilon C\ell}$$

Hoặc lấy logarit hai vế: $$\log\frac{I_0}{I} = \varepsilon C\ell$$

Giải thích:

• Cường độ ánh sáng giảm theo hàm mũ khi đi qua dung dịch
• Tốc độ suy giảm phụ thuộc vào $\varepsilon$, $C$, và $\ell$

📌 Dạng 2: Theo độ hấp thụ (Quan trọng nhất!)

$$\boxed{A = \varepsilon C\ell}$$

Đây là công thức QUAN TRỌNG NHẤT và được sử dụng phổ biến nhất trong thực tế!

Trong đó:

• $A$: Độ hấp thụ (absorbance) – không có đơn vị
• $\varepsilon$ (epsilon): Hệ số hấp thụ mol – L·mol⁻¹·cm⁻¹
• $C$: Nồng độ mol của chất hấp thụ – mol/L (M)
• $\ell$ (ell): Chiều dày cuvet – cm

Ưu điểm của công thức này:

• Đơn giản, dễ sử dụng
• Quan hệ tuyến tính giữa A và C
• Thuận tiện cho việc xây dựng đường chuẩn
• Dễ dàng tính toán nồng độ

2. Các công thức liên quan

📌 A. Độ truyền qua (Transmittance)

Định nghĩa: $$T = \frac{I}{I_0}$$

Biểu diễn bằng phần trăm: $$T(%) = \frac{I}{I_0} \times 100%$$

Ý nghĩa:

• T = 1 (100%): Không hấp thụ, ánh sáng truyền qua hoàn toàn
• T = 0.5 (50%): Hấp thụ 50% ánh sáng
• T = 0 (0%): Hấp thụ toàn bộ ánh sáng

📌 B. Liên hệ giữa A và T

Từ độ truyền qua sang độ hấp thụ: $$\boxed{A = -\log T = \log\frac{1}{T} = \log\frac{I_0}{I}}$$

Từ độ hấp thụ sang độ truyền qua: $$\boxed{T = 10^{-A}}$$

Bảng chuyển đổi nhanh:

Quan sát:

• A và T có quan hệ nghịch biến
• A tăng → T giảm (hấp thụ nhiều hơn)
• Quan hệ logarit, không phải tuyến tính

📌 C. Độ hấp thụ theo cơ số tự nhiên e

Trong một số tài liệu, người ta dùng logarit tự nhiên:

$$A = \ln\frac{I_0}{I} = \alpha C\ell$$

Trong đó:

• $\alpha = 2.303\varepsilon$ (hệ số hấp thụ Napierian)
• $2.303 = \ln(10)$ (hệ số chuyển đổi)

Lưu ý: Công thức này ít phổ biến hơn, thường dùng logarit thập phân.

3. Giải thích ý nghĩa công thức

Từ công thức chính: $A = \varepsilon C\ell$

a) Độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ C:

$$A \propto C \quad \text{(khi } \varepsilon \text{ và } \ell \text{ không đổi)}$$

Ý nghĩa:

• Nồng độ chất hấp thụ càng lớn → số phân tử/ion hấp thụ càng nhiều
• Lượng ánh sáng bị hấp thụ càng nhiều → A càng lớn
• Đây là cơ sở để xác định nồng độ bằng phép đo quang phổ

Ứng dụng:

• Vẽ đồ thị A theo C → đường thẳng qua gốc
• Từ A đo được → suy ra C chưa biết

b) Độ hấp thụ tỉ lệ thuận với chiều dày ℓ:

$$A \propto \ell \quad \text{(khi } \varepsilon \text{ và } C \text{ không đổi)}$$

Ý nghĩa:

• Ánh sáng đi qua lớp dung dịch càng dày → gặp càng nhiều phân tử hấp thụ
• Lượng ánh sáng bị hấp thụ càng nhiều → A càng lớn

Ứng dụng:

• Thường dùng cuvet chuẩn: ℓ = 1 cm
• Có thể dùng cuvet khác: ℓ = 0.5 cm, 2 cm, 5 cm, 10 cm
• Chọn ℓ phù hợp với nồng độ mẫu

c) Độ hấp thụ phụ thuộc vào hệ số ε:

$$A = \varepsilon C\ell \quad \text{(} \varepsilon \text{ đặc trưng cho chất và bước sóng)}$$

Ý nghĩa:

• $\varepsilon$ lớn → chất hấp thụ mạnh tại bước sóng đó → phương pháp nhạy
• $\varepsilon$ khác nhau cho các chất khác nhau
• $\varepsilon$ thay đổi theo bước sóng → cần chọn λ phù hợp

Giá trị ε điển hình:

• Chất hấp thụ yếu: ε < 100 L·mol⁻¹·cm⁻¹
• Chất hấp thụ trung bình: ε = 100 – 10,000
• Chất hấp thụ mạnh: ε > 10,000
• KMnO₄ (λ = 525 nm): ε ≈ 2,400 L·mol⁻¹·cm⁻¹

4. Ví dụ tính toán

Ví dụ 1: Tính độ hấp thụ

Bài toán: Dung dịch KMnO₄ có nồng độ C = 0.001 M, chiếu qua cuvet dày ℓ = 1 cm. Tại bước sóng λ = 525 nm, hệ số hấp thụ mol ε = 2400 L·mol⁻¹·cm⁻¹. Tính độ hấp thụ A?

Lời giải:

Áp dụng công thức Lambert-Beer: $$A = \varepsilon C\ell$$ $$A = 2400 \times 0.001 \times 1$$ $$A = 2.4$$

Kết luận: Độ hấp thụ của dung dịch là 2.4.

Ví dụ 2: Tính độ truyền qua

Bài toán: Từ kết quả ví dụ 1, với A = 2.4, tính độ truyền qua T (biểu diễn bằng %)?

Lời giải:

Từ công thức liên hệ: $$T = 10^{-A}$$ $$T = 10^{-2.4}$$ $$T \approx 0.00398$$

Biểu diễn bằng phần trăm: $$T(%) = 0.00398 \times 100% \approx 0.40%$$

Kết luận: Chỉ có khoảng 0.4% ánh sáng truyền qua dung dịch, nghĩa là 99.6% bị hấp thụ!

Nhận xét: Dung dịch này hấp thụ rất mạnh, có màu tím đậm đặc trưng của KMnO₄.

Ví dụ 3: Tính nồng độ chưa biết

Bài toán: Đo một dung dịch chứa Fe³⁺ (tạo phức màu với SCN⁻), thu được A = 0.45. Biết ε = 6800 L·mol⁻¹·cm⁻¹, cuvet dày ℓ = 1 cm. Tính nồng độ Fe³⁺?

Lời giải:

Từ công thức: $A = \varepsilon C\ell$

Suy ra: $$C = \frac{A}{\varepsilon\ell}$$ $$C = \frac{0.45}{6800 \times 1}$$ $$C = 6.62 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$$ $$C \approx 6.6 \times 10^{-5} \text{ M}$$

Kết luận: Nồng độ Fe³⁺ trong dung dịch là $6.6 \times 10^{-5}$ M.

IV. ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG ĐỊNH LUẬT LAMBERT-BEER

1. Điều kiện bắt buộc

Để định luật Lambert-Beer được áp dụng chính xác, cần thỏa mãn các điều kiện sau:

📌 A. Ánh sáng đơn sắc (bước sóng duy nhất)

Yêu cầu:

• Phải sử dụng ánh sáng có bước sóng xác định, hẹp
• Không được dùng ánh sáng trắng (chứa nhiều bước sóng)

Lý do:

• Hệ số hấp thụ ε thay đổi theo bước sóng
• Nếu dùng nhiều bước sóng → mỗi λ có ε khác nhau → không thể áp dụng công thức duy nhất

Giải pháp:

• Sử dụng bộ đơn sắc (monochromator): lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ
• Chọn đúng bước sóng (thường là λ_max – bước sóng hấp thụ cực đại)

📌 B. Chùm sáng song song

Yêu cầu:

• Ánh sáng phải đi theo các tia song song nhau
• Vuông góc với bề mặt cuvet

Lý do:

• Nếu ánh sáng phân kỳ hoặc hội tụ → chiều dài quang học thực tế khác ℓ
• Gây sai lệch trong phép đo

Giải pháp:

• Máy quang phổ hiện đại đã được thiết kế với hệ thống chuẩn trực
• Đặt cuvet đúng vị trí trong máy

📌 C. Dung dịch loãng (C < 0.01 M)

Yêu cầu:

• Nồng độ chất hấp thụ phải đủ nhỏ, thường C < 0.01 M (10 mM)
• Với một số chất: C < 0.001 M

Lý do:

• Ở nồng độ cao: các phân tử/ion gần nhau
• Xảy ra tương tác phân tử-phân tử (điện tích, liên kết hidro…)
• Làm thay đổi cấu trúc electron → ε thay đổi
• Định luật không còn tuyến tính

Giải pháp:

• Pha loãng mẫu nếu nồng độ quá cao
• Tính toán lại nồng độ sau khi đo: $C_{gốc} = C_{đo} \times$ (hệ số pha loãng)

📌 D. Không xảy ra phản ứng hóa học

Yêu cầu:

• Chất hấp thụ phải ổn định, không bị phân hủy
• Không tạo sản phẩm mới
• Không phản ứng với dung môi hoặc tạp chất

Lý do:

• Nếu chất A phản ứng tạo chất B → nồng độ A giảm
• Đo được A không còn tương ứng với C ban đầu
• Nếu B cũng hấp thụ → nhiễu kết quả

Giải pháp:

• Đo ngay sau khi chuẩn bị mẫu
• Bảo quản mẫu trong điều kiện thích hợp (tránh ánh sáng, nhiệt)
• Kiểm tra độ ổn định của mẫu theo thời gian

📌 E. Nhiệt độ không đổi

Yêu cầu:

• Giữ nhiệt độ ổn định trong quá trình đo
• Thường đo ở nhiệt độ phòng (20-25°C)

Lý do:

• Nhiệt độ thay đổi → cấu trúc phân tử thay đổi
• Năng lượng kích thích electron thay đổi
• Hệ số ε thay đổi

Giải pháp:

• Đo trong phòng có điều hòa nhiệt độ
• Để mẫu cân bằng nhiệt với môi trường trước khi đo
• Sử dụng giá đỡ cuvet có kiểm soát nhiệt độ (nếu cần)

2. Các yếu tố gây sai lệch

❌ A. Sai lệch hóa học

Nguyên nhân:

Phân ly/liên hợp của chất hấp thụ:

• Ví dụ: Chỉ thị axit-bazơ có màu khác nhau ở pH khác nhau
• Nếu pH thay đổi → cân bằng phân ly thay đổi → nồng độ dạng hấp thụ thay đổi

Phản ứng với dung môi:

• Một số chất phản ứng với nước
• Tạo sản phẩm có phổ hấp thụ khác

Tạo phức với tạp chất:

• Ion kim loại tạo phức với ligand không mong muốn
• Làm thay đổi phổ hấp thụ

Giải pháp:

• Kiểm soát pH chặt chẽ (dùng dung dịch đệm)
• Loại bỏ tạp chất có thể phản ứng
• Thêm chất che để ngăn phản ứng phụ

❌ B. Sai lệch vật lý

Tán xạ ánh sáng:

• Do hạt lơ lửng trong dung dịch (bụi, kết tủa)
• Ánh sáng bị tán xạ → I_đo < I_thực → A_đo > A_thực
• Giải pháp: Lọc dung dịch qua màng lọc 0.45 μm

Huỳnh quang:

• Một số chất hấp thụ ánh sáng rồi phát ra ánh sáng bước sóng khác
• Detector thu cả ánh sáng phát huỳnh quang → I_đo > I_thực → A_đo < A_thực
• Giải pháp: Đo ở bước sóng không gây huỳnh quang, hoặc dùng detector có bộ lọc

Phản xạ tại bề mặt cuvet:

• Cuvet bẩn, có vết xước
• Giải pháp: Vệ sinh cuvet sạch, dùng cuvet chất lượng tốt

❌ C. Sai lệch do nồng độ cao

Nguyên nhân:

• Khi C > 0.01 M: khoảng cách giữa các phân tử quá gần
• Tương tác điện tích giữa các ion/phân tử
• Thay đổi phân bố electron → ε thay đổi

Biểu hiện:

• Đồ thị A theo C không còn là đường thẳng
• Uốn cong xuống (A tăng chậm hơn C)

Giải pháp:

• Luôn làm việc ở vùng nồng độ loãng
• Pha loãng mẫu nếu cần

❌ D. Sai lệch do dụng cụ

Ánh sáng không hoàn toàn đơn sắc:

• Bộ đơn sắc có độ phân giải thấp
• Ánh sáng tạp lọt qua

Ánh sáng phản xạ, tán xạ trong máy:

• Thiết kế máy không tốt
• Ánh sáng lạc đường vào detector

Chùm sáng không song song:

• Quang học máy không chuẩn

Giải pháp:

• Sử dụng máy quang phổ chất lượng tốt
• Hiệu chuẩn máy định kỳ
• Bảo dưỡng máy đúng quy trình

3. Giải pháp đảm bảo điều kiện

Về thiết bị:

• Sử dụng máy quang phổ UV-Vis chất lượng tốt
• Có bộ đơn sắc với độ phân giải cao (bandwidth < 2 nm)
• Hiệu chuẩn máy định kỳ bằng chuẩn chứng nhận

Về mẫu:

• Chuẩn bị dung dịch loãng: C < 0.01 M
• Pha loãng mẫu nếu nồng độ quá cao
• Lọc mẫu qua màng lọc 0.45 μm để loại hạt lơ lửng

Về điều kiện đo:

• Đo tại nhiệt độ phòng ổn định (20-25°C)
• Đo tại bước sóng hấp thụ cực đại λ_max (độ nhạy cao nhất, ít bị ảnh hưởng bởi sai số bước sóng)
• Đo trong thời gian ngắn sau khi chuẩn bị

Về cuvet:

• Sử dụng cuvet sạch, trong suốt, không trầy xước
• Cuvet thạch anh cho vùng UV (< 350 nm)
• Cuvet thủy tinh cho vùng Vis (> 350 nm)
• Lau sạch mặt ngoài cuvet trước khi đo

Về quy trình:

• Hiệu chỉnh baseline (zero) bằng mẫu trắng (dung môi thuần khiết)
• Đo lặp lại ít nhất 3 lần, lấy giá trị trung bình
• Kiểm tra độ lặp lại của phép đo

V. ỨNG DỤNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐO

1. Xác định nồng độ chất trong dung dịch

Phương pháp đường chuẩn (Calibration curve)

Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định nồng độ chất chưa biết.

Nguyên tắc: Xây dựng đồ thị A theo C từ các dung dịch chuẩn đã biết nồng độ, sau đó sử dụng đồ thị này để suy ra nồng độ mẫu chưa biết từ độ hấp thụ đo được.

Các bước thực hiện:

Bước 1: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn

• Pha dãy dung dịch có nồng độ tăng dần: C₁, C₂, C₃, C₄, C₅
• Thường pha 5-7 nồng độ trong khoảng dự kiến của mẫu
• Ví dụ: 1, 2, 3, 4, 5 (×10⁻⁴ M)

Bước 2: Đo độ hấp thụ

• Đo tại bước sóng λ_max
• Ghi lại A₁, A₂, A₃, A₄, A₅ tương ứng
• Đo lặp lại để đảm bảo độ chính xác

Bước 3: Vẽ đồ thị A = f(C)

A │        ●
  │      ●
  │    ●        A = εℓC (đường thẳng)
  │  ●          Hệ số góc = εℓ
  │●
  └────────────────→ C
  0

• Trục hoành: Nồng độ C
• Trục tung: Độ hấp thụ A
• Lý tưởng: Đường thẳng qua gốc tọa độ
• Hệ số góc: $k = \varepsilon\ell$

Bước 4: Đo mẫu chưa biết

• Chuẩn bị mẫu giống như mẫu chuẩn
• Đo độ hấp thụ: $A_x$

Bước 5: Tính nồng độ mẫu

Cách 1: Từ đồ thị

• Tìm $A_x$ trên trục tung
• Kẻ đường ngang cắt đường chuẩn
• Hạ đường xuống trục hoành → đọc $C_x$

Cách 2: Từ phương trình đường thẳng

Nếu đường chuẩn có dạng: $A = kC + b$

Thì: $C_x = \frac{A_x – b}{k}$

Nếu đường thẳng qua gốc (b = 0): $$C_x = \frac{A_x}{k} = \frac{A_x}{\varepsilon\ell}$$

Cách 3: So sánh với một mẫu chuẩn $$C_x = C_{chuẩn} \times \frac{A_x}{A_{chuẩn}}$$

2. Ứng dụng trong các lĩnh vực

📌 A. Hóa học phân tích

Định lượng ion kim loại:

• Fe²⁺, Fe³⁺: Tạo phức màu với o-phenanthrolin, SCN⁻
• Cu²⁺: Tạo phức với amoniac (màu xanh đậm)
• Cr₂O₇²⁻: Màu da cam đặc trưng (λ_max = 350 nm)
• Ni²⁺: Tạo phức với dimetylglyoxim

Xác định chất màu, thuốc nhuộm:

• Methyl orange, phenolphthalein (chỉ thị axit-bazơ)
• Thuốc nhuộm dệt
• Chất màu thực phẩm

Phân tích hỗn hợp:

• Nếu các chất không tương tác và có λ_max khác nhau
• Đo ở nhiều bước sóng
• Giải hệ phương trình tuyến tính

📌 B. Y học – Sinh học

Xét nghiệm máu:

• Hemoglobin: Đo ở 540 nm (phức với cyanide)
• Glucose: Phản ứng với glucose oxidase → chất màu
• Bilirubin: Đo trực tiếp (màu vàng), λ = 450-460 nm
• Cholesterol: Phản ứng enzyme tạo sản phẩm màu

Phân tích protein:

• Phương pháp Bradford: Protein + Coomassie Brilliant Blue
• Phương pháp Lowry
• Phương pháp BCA (bicinchoninic acid)

Đo acid nucleic (DNA/RNA):

• DNA/RNA hấp thụ UV ở λ = 260 nm
• Protein hấp thụ ở λ = 280 nm
• Tỉ số A₂₆₀/A₂₈₀ đánh giá độ tinh khiết

Đo hoạt độ enzyme:

• Theo dõi sự thay đổi A theo thời gian
• Tốc độ phản ứng enzyme tỉ lệ với độ dốc đường cong A(t)

📌 C. Môi trường

Đo ô nhiễm nước:

• Nitrat (NO₃⁻): Phản ứng với thuốc thử tạo màu vàng
• Phosphat (PO₄³⁻): Tạo phức xanh molybden
• Kim loại nặng: Pb, Cd, Hg (sau tạo phức màu)
• COD (Chemical Oxygen Demand): Oxy hóa bằng K₂Cr₂O₇, đo màu Cr₂O₇²⁻ còn lại

Kiểm tra chất lượng không khí:

• NO₂: Hấp thụ ở vùng UV-Vis
• SO₂: Phản ứng tạo sản phẩm màu
• O₃: Đo trực tiếp ở 254 nm

Phân tích nước thải:

• Các chất hữu cơ màu
• Phenol, chất nhuộm công nghiệp
• Đánh giá mức độ xử lý

📌 D. Thực phẩm

Xác định vitamin:

• Vitamin C: Phản ứng với 2,6-dichlorophenolindophenol
• Vitamin A: Đo ở 325 nm
• Vitamin E: Phản ứng tạo màu

Đo màu sắc thực phẩm:

• Carotenoid (màu cam, vàng)
• Chlorophyll (màu xanh)
• Anthocyanin (màu đỏ, tím)

Phát hiện phụ gia:

• Chất bảo quản (benzoat, sorbat)
• Chất tạo màu nhân tạo
• Chất chống oxy hóa

📌 E. Dược phẩm

Kiểm soát chất lượng:

• Xác định hàm lượng dược chất trong viên nén, viên nang
• Kiểm tra độ tinh khiết
• Phát hiện tạp chất

Nghiên cứu động học dược:

• Theo dõi nồng độ dược chất trong máu theo thời gian
• Tính toán thời gian bán hủy, sinh khả dụng
• Tối ưu hóa liều lượng

Kiểm tra độ ổn định:

• Theo dõi sự phân hủy dược chất theo thời gian
• Xác định hạn sử dụng

3. Thiết bị đo – Máy quang phổ UV-Vis

Thành phần chính của máy quang phổ

1. Nguồn sáng:

• Đèn halogen/tungsten: Vùng khả kiến (Vis), 350-900 nm
• Đèn deuterium (D₂): Vùng tử ngoại (UV), 190-350 nm
• Máy có cả hai đèn, tự động chuyển đổi theo λ

2. Bộ đơn sắc (Monochromator):

• Lăng kính: Tán sắc ánh sáng
• Cách tử nhiễu xạ (grating): Phổ biến hơn, độ phân giải cao
• Khe (slit) kiểm soát độ rộng chùm sáng

3. Cuvet (cuvette):

• Thạch anh (quartz): Cho vùng UV + Vis
• Thủy tinh (glass): Chỉ cho vùng Vis
• Plastic: Dùng một lần, vùng Vis
• Kích thước chuẩn: ℓ = 1 cm

4. Detector (Đầu dò):

• Photomultiplier tube (PMT): Độ nhạy cao
• Photodiode array (PDA): Đo nhanh, đồng thời nhiều λ
• Chuyển tín hiệu ánh sáng → tín hiệu điện

5. Bộ xử lý và hiển thị:

• Vi xử lý xử lý tín hiệu
• Màn hình hiển thị A, T, C, phổ
• Kết nối máy tính, in kết quả

Quy trình đo mẫu

Bước 1: Bật máy và ổn định

• Bật nguồn, đợi 15-30 phút
• Đèn phải đạt cường độ ổn định

Bước 2: Chọn bước sóng

• Chọn λ_max (bước sóng hấp thụ cực đại)
• Nếu chưa biết: quét phổ (scan) từ 200-800 nm

Bước 3: Hiệu chỉnh baseline (Zero/Blank)

• Đổ dung môi thuần khiết (mẫu trắng) vào cuvet
• Đặt vào máy, nhấn “Zero” hoặc “Blank”
• Máy hiệu chỉnh I₀

Bước 4: Đo mẫu chuẩn

• Đo dãy dung dịch chuẩn
• Ghi lại A₁, A₂, A₃, …
• Vẽ đường chuẩn

Bước 5: Đo mẫu thử

• Đổ mẫu thử vào cuvet sạch
• Đặt vào máy, đọc $A_x$
• Tính nồng độ từ đường chuẩn

Lưu ý:

• Luôn lau sạch mặt ngoài cuvet bằng giấy mềm
• Cầm cuvet ở phần trên, không chạm vào mặt trong suốt
• Đổ đầy cuvet (không có bọt khí)
• Đặt cuvet đúng hướng (nếu có mặt trong suốt và mờ)

VI. BẢNG CÔNG THỨC TỔNG HỢP

A. Công thức chính

B. Công thức mở rộng

C. Giới hạn định lượng tối ưu

Giải thích:

• Vùng A = 0.2 – 0.8: Sai số quang học nhỏ nhất
• A < 0.2: Tín hiệu yếu, sai số lớn
• A > 2.0: Rất ít ánh sáng truyền qua, detector không chính xác

VII. BÀI TẬP VỀ ĐỊNH LUẬT LAMBERT-BEER

Dạng 1: Tính độ hấp thụ A

Đề bài: Một dung dịch có nồng độ C = 2×10⁻⁴ M được đo trong cuvet dày ℓ = 1 cm. Hệ số hấp thụ mol của chất ở bước sóng đo là ε = 15000 L·mol⁻¹·cm⁻¹. Tính độ hấp thụ A của dung dịch?

Lời giải:

Áp dụng định luật Lambert-Beer: $$A = \varepsilon C\ell$$

Thay số: $$A = 15000 \times 2 \times 10^{-4} \times 1$$ $$A = 15000 \times 0.0002$$ $$A = 3.0$$

Kết luận: Độ hấp thụ của dung dịch là A = 3.0.

Nhận xét: A = 3.0 khá lớn, có nghĩa là chất này hấp thụ rất mạnh ở bước sóng này.

Dạng 2: Tính nồng độ C

Đề bài: Đo một dung dịch, thu được độ hấp thụ A = 0.45. Biết hệ số hấp thụ mol ε = 2250 L·mol⁻¹·cm⁻¹ và cuvet dày ℓ = 1 cm. Tính nồng độ C của dung dịch?

Lời giải:

Từ công thức: $A = \varepsilon C\ell$

Suy ra: $$C = \frac{A}{\varepsilon\ell}$$

Thay số: $$C = \frac{0.45}{2250 \times 1}$$ $$C = \frac{0.45}{2250}$$ $$C = 2.0 \times 10^{-4} \text{ mol/L}$$ $$C = 2.0 \times 10^{-4} \text{ M}$$

Kết luận: Nồng độ của dung dịch là $C = 2.0 \times 10^{-4}$ M = 0.2 mM.

Dạng 3: Tính độ truyền qua T

Đề bài: Một dung dịch có độ hấp thụ A = 1.5. Tính độ truyền qua T và biểu diễn bằng phần trăm?

Lời giải:

Từ công thức liên hệ: $$T = 10^{-A}$$

Thay số: $$T = 10^{-1.5}$$ $$T = 0.0316$$

Biểu diễn bằng phần trăm: $$T(%) = 0.0316 \times 100% = 3.16%$$

Kết luận: Độ truyền qua là T = 3.16%, có nghĩa là chỉ có 3.16% ánh sáng truyền qua, còn 96.84% bị hấp thụ.

Kiểm tra ngược lại: $$A = -\log T = -\log(0.0316) = 1.5$$ ✓

Dạng 4: So sánh nồng độ hai mẫu

Đề bài: Hai dung dịch chứa cùng một chất, đo trong cùng loại cuvet. Mẫu 1 có A₁ = 0.6, mẫu 2 có A₂ = 0.9. Tính tỉ số nồng độ C₁/C₂?

Lời giải:

Vì cùng chất (cùng ε) và cùng cuvet (cùng ℓ), ta có: $$A_1 = \varepsilon C_1\ell$$ $$A_2 = \varepsilon C_2\ell$$

Lập tỉ số: $$\frac{A_1}{A_2} = \frac{\varepsilon C_1\ell}{\varepsilon C_2\ell} = \frac{C_1}{C_2}$$

Vậy: $$\frac{C_1}{C_2} = \frac{A_1}{A_2} = \frac{0.6}{0.9} = \frac{2}{3}$$

Kết luận: Nồng độ mẫu 1 bằng 2/3 nồng độ mẫu 2, hay $C_1 = \frac{2}{3}C_2$.

Dạng 5: Bài toán pha loãng

Đề bài: Một dung dịch gốc có độ hấp thụ A_gốc = 1.2. Pha loãng dung dịch này 5 lần (thêm dung môi để thể tích tăng gấp 5). Tính độ hấp thụ A_loãng của dung dịch sau khi pha loãng?

Lời giải:

Phân tích:

• Pha loãng 5 lần → Nồng độ giảm 5 lần
• $C_{loãng} = \frac{C_{gốc}}{5}$

Tính A_loãng:

Vì $A = \varepsilon C\ell$ và ε, ℓ không đổi: $$\frac{A_{loãng}}{A_{gốc}} = \frac{C_{loãng}}{C_{gốc}} = \frac{1}{5}$$

Vậy: $$A_{loãng} = \frac{A_{gốc}}{5} = \frac{1.2}{5} = 0.24$$

Kết luận: Độ hấp thụ sau khi pha loãng là A = 0.24.

Lưu ý: Độ hấp thụ giảm theo cùng tỉ lệ với nồng độ.

Dạng 6: Xây dựng và sử dụng đường chuẩn

Đề bài: Đo dãy dung dịch chuẩn (cuvet ℓ = 1 cm):

Một mẫu chưa biết nồng độ được đo, có A_X = 0.52. Tính nồng độ C_X của mẫu?

Lời giải:

Cách 1: Tính hệ số ε từ dữ liệu

Chọn một điểm bất kỳ, ví dụ điểm đầu tiên: $$\varepsilon = \frac{A}{C\ell} = \frac{0.15}{1.0 \times 10^{-4} \times 1} = \frac{0.15}{1.0 \times 10^{-4}} = 1500 \text{ L·mol}^{-1}\text{·cm}^{-1}$$

Kiểm tra với các điểm khác:

• Điểm 2: $\varepsilon = \frac{0.30}{2.0 \times 10^{-4}} = 1500$ ✓
• Điểm 3: $\varepsilon = \frac{0.45}{3.0 \times 10^{-4}} = 1500$ ✓
• Điểm 4: $\varepsilon = \frac{0.60}{4.0 \times 10^{-4}} = 1500$ ✓

Tính C_X: $$C_X = \frac{A_X}{\varepsilon\ell} = \frac{0.52}{1500 \times 1} = \frac{0.52}{1500} = 3.47 \times 10^{-4} \text{ M}$$

Cách 2: Sử dụng tỉ lệ so với mẫu chuẩn

Chọn mẫu chuẩn gần nhất, ví dụ C₃ = 3.0×10⁻⁴ M có A₃ = 0.45:

$$\frac{C_X}{C_3} = \frac{A_X}{A_3}$$

$$C_X = C_3 \times \frac{A_X}{A_3} = 3.0 \times 10^{-4} \times \frac{0.52}{0.45}$$

$$C_X = 3.0 \times 10^{-4} \times 1.156 = 3.47 \times 10^{-4} \text{ M}$$

Cách 3: Từ đồ thị (nếu vẽ)

• Vẽ đồ thị A theo C
• Các điểm nằm trên đường thẳng qua gốc
• Phương trình: $A = 1500C$ (với C tính bằng mol/L)
• Tìm A_X = 0.52 trên trục tung
• Kẻ ngang cắt đường thẳng
• Hạ xuống trục hoành → C_X ≈ 3.47×10⁻⁴ M

Kết luận: Nồng độ mẫu X là $C_X = 3.47 \times 10^{-4}$ M.

Dạng 7: Hỗn hợp các chất không tương tác

Đề bài: Một hỗn hợp gồm hai chất A và B không tương tác với nhau. Đo hỗn hợp thu được A_tổng = 0.8. Biết riêng chất A trong hỗn hợp có A₁ = 0.3. Tính độ hấp thụ A₂ của chất B?

Lời giải:

Nguyên tắc cộng tính của độ hấp thụ:

Khi các chất không tương tác, độ hấp thụ tổng bằng tổng độ hấp thụ của từng chất: $A_{tổng} = A_1 + A_2 + A_3 + …$

Áp dụng: $A_2 = A_{tổng} – A_1 = 0.8 – 0.3 = 0.5$

Kết luận: Độ hấp thụ của chất B là A₂ = 0.5.

Lưu ý: Công thức này chỉ đúng khi:

• Các chất không phản ứng với nhau
• Đo ở cùng bước sóng
• Dùng cùng cuvet

Dạng 8: Tính hệ số hấp thụ mol ε

Đề bài: Dung dịch có nồng độ C = 5×10⁻⁵ M, đo trong cuvet ℓ = 1 cm, thu được A = 0.75. Tính hệ số hấp thụ mol ε?

Lời giải:

Từ công thức: $A = \varepsilon C\ell$

Suy ra: $\varepsilon = \frac{A}{C\ell}$

Thay số: $\varepsilon = \frac{0.75}{5 \times 10^{-5} \times 1}$ $\varepsilon = \frac{0.75}{5 \times 10^{-5}}$ $\varepsilon = 15000 \text{ L·mol}^{-1}\text{·cm}^{-1}$

Kết luận: Hệ số hấp thụ mol là ε = 15000 L·mol⁻¹·cm⁻¹.

Ý nghĩa: Giá trị ε lớn cho thấy chất này hấp thụ mạnh ở bước sóng đo, phương pháp phân tích sẽ có độ nhạy cao.

VIII. MẸO VÀ LƯU Ý

1. Mẹo nhớ công thức

Công thức gốc Lambert-Beer:

$\boxed{A = \varepsilon C\ell}$

Cách nhớ: “Absorbance = Epsilon × Concentration × Length”

• A: Absorbance (độ hấp thụ)
• E: Epsilon (hệ số hấp thụ mol)
• C: Concentration (nồng độ)
• L: Length (chiều dài cuvet)

Thứ tự: “A-E-C-L” hoặc “A bằng E nhân C nhân L”

Quan hệ giữa A và T:

$\boxed{A = -\log T}$

Cách nhớ:

• A và T ngược nhau
• A ↑ (hấp thụ nhiều) → T ↓ (truyền qua ít)
• A ↓ (hấp thụ ít) → T ↑ (truyền qua nhiều)
• Có dấu trừ và logarit

Quan hệ đặc biệt:

• A = 0 → T = 1 (100%) – không hấp thụ
• A = 1 → T = 0.1 (10%) – hấp thụ 90%
• A = 2 → T = 0.01 (1%) – hấp thụ 99%

2. Các sai lầm thường gặp

❌ SAI LẦM 1: Nhầm đơn vị

Sai:

• Dùng C theo mg/L hoặc g/L
• Dùng ℓ theo mm hoặc m

Đúng:

• C phải là mol/L (M)
• ℓ phải là cm
• ε có đơn vị L·mol⁻¹·cm⁻¹

Chuyển đổi:

• 1 mm = 0.1 cm
• 1 mg/L → chia cho khối lượng mol (g/mol) → mol/L

❌ SAI LẦM 2: Quên kiểm tra điều kiện

Sai: Áp dụng định luật cho mọi trường hợp

Đúng: Kiểm tra điều kiện:

• Dung dịch phải loãng (C < 0.01 M)
• Ánh sáng phải đơn sắc
• Không có phản ứng hóa học
• Nhiệt độ ổn định

❌ SAI LẦM 3: Nhầm lẫn A và T

Phân biệt:

Nhớ:

• A càng lớn → hấp thụ càng nhiều → dung dịch càng đậm màu
• T càng lớn → truyền qua càng nhiều → dung dịch càng loãng/trong suốt

❌ SAI LẦM 4: Không hiệu chỉnh baseline

Sai: Đo mẫu trực tiếp mà không hiệu chỉnh máy với mẫu trắng

Đúng:

• Luôn đo mẫu trắng (blank) trước
• Mẫu trắng = dung môi thuần khiết + mọi thứ khác trừ chất cần đo
• Nhấn “Zero” hoặc “Blank” để hiệu chỉnh

Mục đích:

• Loại trừ hấp thụ của dung môi
• Loại trừ ảnh hưởng của cuvet
• Đảm bảo $I_0$ chính xác

❌ SAI LẦM 5: Đo ở vùng A không tối ưu

Sai:

• A quá nhỏ (< 0.1) → sai số lớn
• A quá lớn (> 2.0) → vượt khả năng đo

Đúng:

• Vùng tối ưu: A = 0.2 – 0.8
• Nếu A < 0.2: Tăng nồng độ hoặc dùng cuvet dày hơn
• Nếu A > 2.0: Pha loãng mẫu

3. Lưu ý khi làm bài tập

Bước 1: Xác định đại lượng

• Đọc kỹ đề bài
• Ghi rõ đại lượng cho: A, C, ℓ, ε
• Xác định đại lượng cần tìm

Bước 2: Kiểm tra đơn vị

• C phải là mol/L (M)
• ℓ phải là cm
• Chuyển đổi nếu cần

Bước 3: Chọn công thức phù hợp

• Tìm A: $A = \varepsilon C\ell$
• Tìm C: $C = \frac{A}{\varepsilon\ell}$
• Tìm ε: $\varepsilon = \frac{A}{C\ell}$
• Chuyển A ↔ T: $A = -\log T$ hoặc $T = 10^{-A}$

Bước 4: Thay số và tính toán

• Thay số cẩn thận
• Sử dụng máy tính khoa học
• Chú ý số mũ (×10⁻⁴, ×10⁻⁵…)

Bước 5: Kiểm tra kết quả

• Kết quả có hợp lý không?
• A phải ≥ 0
• C phải > 0
• T phải nằm trong khoảng 0-1

Bước 6: Viết đáp án

• Ghi rõ đơn vị
• Làm tròn hợp lý (2-3 chữ số có nghĩa)

4. Mẹo làm bài nhanh

Với cuvet chuẩn ℓ = 1 cm: $A = \varepsilon C$

→ Bỏ qua ℓ trong tính toán

So sánh hai mẫu cùng chất, cùng cuvet: $\frac{C_1}{C_2} = \frac{A_1}{A_2}$

→ Không cần biết ε

Pha loãng n lần: $C_{mới} = \frac{C_{cũ}}{n}, \quad A_{mới} = \frac{A_{cũ}}{n}$

→ Nồng độ và A giảm cùng tỉ lệ

Bảng chuyển đổi nhanh A ↔ T:

→ Nhớ một vài giá trị để ước lượng nhanh

IX. KẾT LUẬN

Bài viết đã trình bày đầy đủ và chi tiết về Định luật Lambert-Beer:

Phát biểu định luật:

Độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ chất hấp thụ và chiều dày lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua.

Công thức cốt lõi: $\boxed{A = \varepsilon C\ell}$

Đây là công thức QUAN TRỌNG NHẤT, cần học thuộc và vận dụng thành thạo.

Các công thức liên quan:

• Độ truyền qua: $T = \frac{I}{I_0}$
• Liên hệ A và T: $A = -\log T$ và $T = 10^{-A}$
• Tính nồng độ: $C = \frac{A}{\varepsilon\ell}$

5 điều kiện áp dụng:

1. Ánh sáng đơn sắc
2. Chùm sáng song song
3. Dung dịch loãng (C < 0.01 M)
4. Không có phản ứng hóa học
5. Nhiệt độ không đổi

Ứng dụng rộng rãi:

• Hóa học phân tích: Xác định nồng độ
• Y học: Xét nghiệm máu, nước tiểu
• Môi trường: Đo ô nhiễm nước, không khí
• Thực phẩm: Kiểm tra chất lượng, vitamin
• Dược phẩm: Kiểm soát hàm lượng dược chất

Phương pháp đường chuẩn:

• Xây dựng đồ thị A = f(C)
• Đường thẳng qua gốc
• Từ A_mẫu → suy ra C_mẫu

8 dạng bài tập có lời giải chi tiết

Ý nghĩa vật lý của định luật

Định luật Lambert (1760):

• Cường độ ánh sáng suy giảm theo hàm mũ khi đi qua môi trường hấp thụ
• Độ hấp thụ tỉ lệ với chiều dày lớp vật chất: $A \propto \ell$

Định luật Beer (1852):

• Độ hấp thụ tỉ lệ với nồng độ chất hấp thụ: $A \propto C$
• Số phân tử hấp thụ càng nhiều → hấp thụ càng mạnh

Kết hợp Lambert + Beer:

• Độ hấp thụ phụ thuộc đồng thời vào cả C và ℓ
• Quan hệ tuyến tính: $A = \varepsilon C\ell$
• Hệ số ε đặc trưng cho bản chất chất hấp thụ và bước sóng

Bản chất vi mô:

• Photon ánh sáng có năng lượng $E = h\nu = \frac{hc}{\lambda}$
• Phân tử hấp thụ photon → electron kích thích lên mức năng lượng cao hơn
• Số photon bị hấp thụ tỉ lệ với số phân tử (nồng độ) và đường đi (chiều dày)

Cô Trần Thị Bình

(Người kiểm duyệt, ra đề)

Chức vụ: Tổ trưởng chuyên môn Tổ Lý – Hóa – Sinh tại Edus

Trình độ: Cử nhân Sư phạm Vật lý, Hoá Học, Bằng Thạc sĩ, Chức danh nghề nghiệp Giáo viên THPT – Hạng II, Tin học ứng dụng cơ bản, Ngoại ngữ B1

Kinh nghiệm: 12+ năm kinh nghiệm tại Trường THPT Gia Định